Методы исследования

Метод рестрикции-лигирования Рестрикцию осуществляют ферменты эндонуклеазы рестрикции или рестриктазы. Исходно эндонуклеазы рестрикции являются системой защиты бактерий от бактериофагов. Большинство эндонуклеаз рестрикции узнает какой-то определенный сайт в последовательности ДНК. Это палиндром $-$ последовательность, которая по двум цепям ДНК от 5’-конца к 3’-концу читается одинаково. Каждая бактерия синтезирует несколько видоспецифических рестриктаз. Большинство рестриктаз вносят несимметричный двуцепочечный разрыв так, что после разреза появляются одноцепочечные участки. Такие участки называются оверхэнгами. Некоторые рестриктазы вносят разрывы так, что образуются 5’-оверхэнги; некоторые так, что образуются 3’-оверхэнги. Общий термин для всех оверхэнгов $-$ это липкие концы. Генные инженеры используют такие рестриктазы, чтоб вносить в нужные места плазмид разрезы. В коммерческих векторах содержится сайт множественного клонирования MCS, в котором сконцентрировано большое количество палиндромных сайтов узнавания для разных рестриктаз. В этот участок вносится два разреза разными рестриктазами. Из вектора вырезается какой-то кусочек MCS и плазмида становится линейной. В векторе остается два разных липких конца. Вставляется вставка, концы которой комплементарны этим липким концам, плазмида вновь становится кольцевой. Липкие концы на вставке присоединяют на этапе ПЦР за счёт подбора специфических праймеров.