Методы исследования

Электрофорез Электрофорез - это явление подвижности в электрическом поле. За счет своего сахарофосфатного остова нуклеиновые кислоты всегда отрицательно заряжены, из-за чего они будут двигаться к аноду. Разные по размеру нуклеиновые кислоты могут двигаться в среде с разной скоростью. Ученые применяют электрофорез для разделения молекул по их размеру. Допустим, что у нас есть смесь линейных нуклеиновых кислот из какого-то экстракта и мы их ферментативно разрезали на какие-то маленькие фрагменты. Для их разделения и используют электрофорез. Электрофорез проводят в геле. В ванночку, где проводят электрофорез, заливают определенный раствор солей, помещают туда гель, фиксируют его и внутрь этого геля вносят образцы нуклеиновых кислот, которые будут мигрировать внутри этого геля по направлению к аноду. Гели обычно делают из агарозы. При плавлении агарозы с водой этот полисахарид переходит в жидкую консистенцию, а при остывании принимает гелеобразную структуру. При застывании подвижность молекул агарозы уменьшается и внутри геля обводненные молекулы агарозы становятся неподвижны. Так как агароза $-$ это длинный полисахарид, между молекулами агарозы формируются поры. Молекулы нуклеиновых кислот внутри этих пор двигаются с разной скоростью. Чем крупнее молекула, тем больше она застревает в этой сети агарозы и тем медленнее она проходит через поры. На подвижность влияет также удельный заряд молекул. У всех нуклеиновых кислот удельный заряд одинаков, поэтому скорость продвижения нуклеиновых кислот зависит только от размера молекул. После проведения электрофореза гель нужно окрасить. Обычно для окрашивания применяют интеркалирующие красители, то есть красители, которые непосредственно встраиваются в структуру ДНК. В структуре ДНК эти красители могут флуоресцировать при ультрафиолетовом освещении. В результате мы получаем электрофореграммы. Электрофореграммы обычно располагают так, что сверху расположен катод и лунки геля, а снизу анод. Лунки - это углубления в геле, в которые и наливают смесь нуклеиновых кислот. Они имеют прямоугольную форму. Собственно, движущиеся нуклеиновые кислоты также идут прямоугольным фронтом (как линия небольшой толщины) к аноду. Те молекулы ДНК, которые дальше всего прошли, являются самыми короткими, то есть самыми маленькими по молекулярной массе. Если мы добавим в одну из лунок геля маркеры молекулярных масс - смесь нуклеиновых кислот с известной длиной, то на основе их пробега сможем предположить длину неизвестных нуклеиновых кислот, которые мы добавили в соседние лунки.