Методы исследования

Методы генной инженерии С помощью методов генной инженерии, например, можно встроить ген человека в генетический материал бактерии, которая будет нарабатывать закодированный человеческим геном белок. Такой белок, который не является естественным для данного организма (в нашем случае бактерии), называется рекомбинантным. Наработка рекомбинантых белков возможна благодаря технологии конструирования рекомбинантных ДНК. Два самых распространенных метода для такой технологии - это полимеразная цепная реакция (ПЦР) и рестрикция-лигирование. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) $-$ это репликация в пробирке. Но если в клетке репликация включает в себя удвоение всего генома, то в ходе ПЦР мы удваиваем только определенный участок ДНК. Вспомним перечень белков, которые необходимы для репликации в клетке. Топоизомераза - удаляет супервитки. Хеликаза - расщепляет водородные связи и расплетает двуцепочечную ДНК. SSB (RPA у эукариот) - белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК. Праймаза - синтезирует затравки (праймеры) для репликации. ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Ферменты удаления праймеров. Лигаза - «зашивает» одноцепочечные разрывы в ДНК. Но если бы для ПЦР были необходимы все эти белки, метод был бы дорогостоящим, трудоемким и малоэффективным. Поэтому необходимо свести число используемых в ПЦР белков к минимуму. Для проведения ПЦР на первых этапах нужно убрать все топологические сложности вместо топоизомераз, сложности, связанные с расщеплением водородных связей вместо хеликазы, сложности с обратной ренатурацией вместо SSB / RPA белков. Этого можно добиться высокой температурой. Первым этапом ПЦР является термическая денатурация, проводимая при температуре 95 градусов Цельсия. Чтобы не добавлять праймазу, в ПЦР-смесь добавляются готовые ДНК-праймеры в довольно большом количестве. Если мы сразу добавили ДНК-праймеры, то их не надо удалять как РНК-праймеры и не надо затем зашивать одноцепочечные разрывы. Тем самым мы добились того, что в ПЦР-смесь не нужно добавлять ферменты удаления праймеров и лигазы. ДНК-праймеры можно искусственно синтезировать в специально приборе синтезаторе олигонуклеотидов. Этот прибор присоединяет один нуклеотид к другому с очень высокой точностью. Но при увеличении последовательности синтезируемой цепи суммарная точность синтеза будет все время уменьшаться, поэтому с высокой точностью возможно синтезировать только короткие последовательности ДНК, которые и используют в качестве праймеров. ДНК-праймеры должны однозначно указать тот участок ДНК, который мы хотим реплицировать. Эти ДНК-праймеры комплементарны каким-то конкретным участкам конкретной хромосомы. Этап присоединения праймеров называется отжигом праймеров. Для этого этапа необходимо понизить температуру примерно до 60 градусов Цельсия. Следующая стадия ПЦР называется элонгацией. В ходе этого этапа происходит присоединение комплементарных нуклеотидов к цепи ДНК. Для этой стадии необходима ДНК-полимераза. Один цикл последовательно сменяющихся денатурации, отжига праймеров и элонгации называется ПЦР-циклом. Нужный двуцепочечный участок ДНК целевой длины впервые появляется только на третьем ПЦР-цикле.