Методы исследования

Если мы хотим человеческий ген поместить в бактерию, например в кишечную палочку, нужно вспомнить, что молекулярная биология прокариот отличается от молекулярной биологии эукариот. Если мы вставим в бактерию, например, ген инсулина с интронами, то эти интроны внутри прокариотической клетки не будут вырезаться. То есть нам надо избавиться от интронов до того, как мы вставим ген в кишечную палочку. Для избавления от интронов обычно из клеток человека выделяют зрелые мРНК, помещают их в пробирку, где проходит обратная транскрипция, там синтезируется кДНК (комплементарная ДНК) на матрице РНК. Такая кДНК затем используется для ПЦР. После множественной амплификации гена ДНК помещают в плазмиды $-$ кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, являющиеся внехромосомными частями генома бактерий. Плазмида, которую потом будут встраивать в бактерию, называют вектором. Чужеродный участок, который мы встроили в такую плазмиду, называют вставкой. На векторе должна быть специальная последовательность, которая будет позволять плазмиде самостоятельно реплицироваться в бактерии. Это ori-участок. Также необходим бактериальный промотор перед вставленным белок-кодирующим участком и терминатор после этого участка для эффективной транскрипции. Также нужно, чтоб после промотора перед старт-кодоном на нужном расстоянии была последовательность Шально-Дальгарно для реализации трансляции белок-кодирующего участка. Термин, описывающий поглощение бактериальной клеткой плазмиды, называется трансформацией. В лаборатории в основном используют два метода трансформации. Один из них $-$ это тепловой шок: клетки нагреваются до 42 градусов Цельсия, меняются свойства клеточной стенки и мембраны и кишечная палочка получает возможность поглощать плазмиды. Чтобы отделить клетки, подвергнувшиеся трансформации от клеток, не подвергнувшихся трансформации, в плазмиду вставляют участок селективного маркера. Обычно это ген, который несет в себе устойчивость к какому-либо антибиотику. Если высевать бактерии на среду с антибиотиком, выживут только те, которые приняли в себя плазмиду. Далее нужно размножить кишечные палочки в жидкой среде. С твердой среды бактерии высеваются в жидкую среду. Но чтобы вся энергия не уходила на синтез целевого белка, а бактерии в начале процесса могли размножиться до необходимых количеств, нужно приостановить экспрессию рекомбинантного белка. У бактерий есть лактозный оперон, который кодирует ферменты метаболизма лактозы. Этот оперон начинает работать только в среде с лактозой. Когда лактоза появляется в среде, оператор лактозного оперона связывается с лактозой и разрешает экспрессию ферментов метаболизма. Этот оператор можно встроить в плазмиду перед целевым белок-кодирующим участком, чтобы регулировать его экспрессию количеством лактозы в среде. В бактериях можно экспрессировать любой желаемый белок, для этого просто нужно использовать конкретную необходимую вставку. Вектора же обычно отличаются несильно, и их можно купить в виде кольцевой плазмиды, где вставки нет, но есть участок ДНК полилинкер, или MCS (сайт множественного клонирования). По этому участку можно сделать разрез, а потом вставить туда целевой ген. Разрезание участка называется рестрикцией, а сшивание $-$ лигированием.